Pour poursuivre notre série d’articles sur les techniques de purification des protéines, nous nous penchons dans celui-ci sur la SEC ou Size Exclusion Chromatographie, séparation des molécules selon leurs tailles.

Dans la stratégie CEP (Capture, Enhance, Polishing) de purifications des protéines, parmi toutes les techniques disponibles, celle-ci est la plus souvent utilisée.

Techniques chromatographiques

 

Analyse & Purification de Proteines

SEC (Size Exclusion Chromatography) – Chromatographie par exclusion de taille

Pour cette technique, les molécules sont discriminées en fonction de leur taille. L’ordre d’élution est inversement proportionnel au rayon hydrodynamique des protéines, les molécules les plus volumineuses sont donc exclues en premier. La résine chromatographique polymérique, sur base silice ou agarose, est traitée de telle sorte qu’elle ne présente aucune interaction avec les molécules à séparer. De ce fait, l’élution est strictement isocratique.
Pour que la séparation soit la plus efficace possible, la phase stationnaire doit présenter la porosité la plus précise possible.

Il existe un grand nombre de phases mobiles et toutes présentent les mêmes caractéristiques :

  • Solubilise l’échantillon
  • Permette au gel de gonfler
  • Compatible avec les détecteurs
  • Elution isocratique

Buffers ex: TRIS, phosphate, NaCl, & neutral detergent

 

Analytical Purification Technics : SEC

Avantages

  • Rapidité et efficacité des dessalages
  • Conditions douces & haut rendement
  • De nombreux tampons peuvent être utilisés
  • Pour augmenter la résolution (capacité de la colonne à séparer 2 molécules) plusieurs colonnes peuvent être utilisées en série

Désavantages

  • Faible volume d’échantillon à traiter
  • Les échantillons sont dilués
  • Technique longue
SEC

Utilisation

  • Étude des agrégats et du repliement des protéines
  • Dessalage des protéines (ex. après digestion ou modifications chimiques)
  • Étape de polishing (étape finale dans la purification des protéines) dans la stratégie CEP

Autres appellations

  • Gel filtration (GFC) (en tampon)
  • Gel permeation chromatography (GPC) (en solvant)

 

Déroulement d’une séparation en SEC

Particules sphériques packées dans la colonne Application de l’échantillon La phase mobile & l ’échantillon traversent la colonne Les grandes molécules sortent de la colonne en 1er suivies par les autres molécules
1 – Particules sphériques packées dans la colonne 2 – Application de l’échantillon 3 – La phase mobile & l ’échantillon traversent la colonne, les molécules diffusent dans le support 4 – Les grandes molécules sortent de la colonne en 1er suivies par les autres molécules, par ordre de taille. Les molécules plus grandes que les pores ne diffusent pas et sont exclues dans le volume mort

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Déroulement d’une séparation en SEC

 

Influence de la taille des colonnes sur la séparation des protéines

L’augmentation de la longueur des colonnes améliore la résolution.

Une colonne

2 colonnes

Influence de la taille des colonnes sur la séparation des protéines - 1 colonne Influence de la taille des colonnes sur la séparation des protéines - 2 colonnes

Colonnes de 300 mm : Analytique/Micropurification
Colonnes de 600 – 1000 mm : Préparative

 

En savoir plus :